Un filtro de fluorescencia é un compoñente esencial no microscopio de fluorescencia. Un sistema típico ten tres filtros básicos: un filtro de excitación, un filtro de emisión e un espello dicroico. Adoitan envasarse nun cubo para que o grupo se insira xuntos no microscopio.
Como funciona un filtro de fluorescencia?
Filtro de excitación
Os filtros de excitación transmiten luz dunha lonxitude de onda específica e bloquean outras lonxitudes de onda. Pódense usar para producir cores diferentes axustando o filtro para que só pase unha cor. Os filtros de excitación veñen en dous tipos principais: filtros de paso longo e filtros de paso de banda. O excitador adoita ser un filtro pasabanda que pasa só as lonxitudes de onda absorbidas polo fluoróforo, minimizando así a excitación doutras fontes de fluorescencia e bloqueando a luz de excitación na banda de emisión de fluorescencia. Como mostra a liña azul da figura, BP é 460-495, o que significa que só pode pasar pola fluorescencia de 460-495 nm.
Colócase dentro da traxectoria de iluminación dun microscopio de fluorescencia e filtra todas as lonxitudes de onda da fonte de luz excepto o rango de excitación do fluoróforo. A transmisión mínima do filtro determina o brillo e o brillo das imaxes. Recoméndase un mínimo de 40% de transmisión para calquera filtro de excitación, de forma que a transmisión sexa idealmente >85%. O ancho de banda do filtro de excitación debe estar totalmente dentro do intervalo de excitación do fluoróforo de forma que a lonxitude de onda central (CWL) do filtro estea o máis próxima posible á lonxitude de onda máxima de excitación do fluoróforo. A densidade óptica do filtro de excitación (OD) dita a escuridade da imaxe de fondo; O DO é unha medida do ben que un filtro bloquea as lonxitudes de onda fóra do rango de transmisión ou ancho de banda. Recoméndase un DO mínimo de 3,0 pero o ideal é un DO de 6,0 ou superior.
Filtro de emisión
Os filtros de emisión serven para permitir que a fluorescencia desexable da mostra chegue ao detector. Bloquean lonxitudes de onda máis curtas e teñen alta transmisión para lonxitudes de onda máis longas. O tipo de filtro tamén está asociado cun número, por exemplo BA510IF na figura (filtro de barreira de interferencia), esa designación refírese á lonxitude de onda ao 50% da súa transmisión máxima.
As mesmas recomendacións para os filtros de excitación valen para os filtros de emisión: transmisión mínima, ancho de banda, OD e CWL. Un filtro de emisión coa combinación ideal de CWL, transmisión mínima e OD proporciona as imaxes máis brillantes posibles, co bloqueo máis profundo posible e garante a detección dos sinais de emisión máis débiles.
Espello dicroico
O espello dicroico colócase entre o filtro de excitación e o filtro de emisión nun ángulo de 45° e reflicte o sinal de excitación cara ao fluoróforo mentres transmite o sinal de emisión cara ao detector. Os filtros dicroicos e divisores de feixe ideais teñen transicións nítidas entre a máxima reflexión e a máxima transmisión, cunha reflexión >95% para o ancho de banda do filtro de excitación e unha transmisión >90% para o ancho de banda do filtro de emisión. Seleccione o filtro tendo en conta a lonxitude de onda de intersección (λ) do fluoróforo, para minimizar a luz perdida e maximizar a relación sinal-ruído da imaxe fluorescente.
O espello dicroico desta figura é o DM505, chamado así porque 505 nanómetros é a lonxitude de onda ao 50% da transmisión máxima deste espello. A curva de transmisión deste espello mostra unha alta transmisión por encima de 505 nm, unha forte caída na transmisión á esquerda de 505 nanómetros e unha reflectividade máxima á esquerda de 505 nanómetros, pero aínda pode ter algunha transmisión por debaixo de 505 nm.
Cal é a diferenza entre os filtros de paso longo e de paso de banda?
Os filtros de fluorescencia pódense dividir en dous tipos: paso longo (LP) e paso de banda (BP).
Os filtros de paso longo transmiten lonxitudes de onda longas e bloquean as máis curtas. A lonxitude de onda de corte é o valor no 50% da transmisión máxima, e todas as lonxitudes de onda por riba do corte son transmitidas polos filtros de paso longo. Utilízanse frecuentemente en espellos dicroicos e filtros de emisión. Os filtros de paso longo deben utilizarse cando a aplicación require a máxima recollida de emisións e cando a discriminación espectral non é desexable ou necesaria, o que é xeralmente o caso de sondas que xeran unha única especie emisora en exemplares con niveis relativamente baixos de autofluorescencia de fondo.
Os filtros de paso de banda só transmiten unha determinada banda de lonxitude de onda e bloquean outras. Reducen a diafonía ao permitir que só se transmita a parte máis forte do espectro de emisión de fluoróforos, reducen o ruído de autofluorescencia e melloran así a relación sinal-ruído en mostras de autofluorescencia de fondo alto, que os filtros de paso longo non poden ofrecer.
Cantos tipos de conxuntos de filtros de fluorescencia pode proporcionar BestScope?
Algúns tipos comúns de filtros inclúen filtros azuis, verdes e ultravioleta. Como se mostra na táboa.
| Conxunto de filtros | Filtro de excitación | Espello dicroico | Filtro de barreira | Lámpada LED de lonxitude de onda | Aplicación |
| B | BP460-495 | DM505 | BA510 | 485 nm | ·FITC: Método de anticorpos fluorescentes ·Acidina laranxa: ADN, ARN ·Auramina: bacilo tuberculoso ·EGFP, S657, RSGFP |
| G | BP510-550 | DM570 | BA575 | 535 nm | ·Rodamina, TRITC: Método de anticorpos fluorescentes ·Ioduro de propidio: ADN · RFP |
| U | BP330-385 | DM410 | BA420 | 365 nm | ·Observación de autofluorescencia ·DAPI: tinción de ADN ·Hoechest 332528, 33342: usado para a tinción de cromosomas |
| V | BP400-410 | DM455 | BA460 | 405 nm | ·Catecolaminas · 5-hidroxitriptamina ·Tetraciclina: Esqueleto, Dentes |
| R | BP620-650 | DM660 | BA670-750 | 640 nm | · Cy5 ·Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647 |
Os conxuntos de filtros que se usan nas adquisicións de fluorescencia están deseñados arredor das principais lonxitudes de onda utilizadas nas aplicacións de fluorescencia, que se basea nos fluoróforos máis utilizados. Por este motivo, tamén reciben o nome do fluoróforo que están destinados á imaxe, como os cubos de filtro DAPI (azul), FITC (verde) ou TRITC (vermello).
| Conxunto de filtros | Filtro de excitación | Espello dicroico | Filtro de barreira | Lámpada LED de lonxitude de onda |
| FITC | BP460-495 | DM505 | BA510-550 | 485 nm |
| DAPI | BP360-390 | DM415 | BA435-485 | 365 nm |
| TRITC | BP528-553 | DM565 | BA578-633 | 535 nm |
| FL-auramina | BP470 | DM480 | BA485 | 450 nm |
| Texas Red | BP540-580 | DM595 | BA600-660 | 560 nm |
| mCherry | BP542-582 | DM593 | BA605-675 | 560 nm |
Como elixes un filtro de fluorescencia?
1. O principio de selección do filtro de fluorescencia é deixar pasar a luz de fluorescencia/emisión polo extremo da imaxe na medida do posible e bloquear completamente a luz de excitación ao mesmo tempo, para obter a relación sinal-ruído máis alta. Especialmente para a aplicación de microscopio de excitación multifotónica e de reflexión interna total, o ruído débil tamén causará unha gran interferencia no efecto de imaxe, polo que o requisito de relación sinal/ruído é maior.
2. Coñecer o espectro de excitación e emisión do fluoróforo. Para construír un conxunto de filtros de fluorescencia que xere unha imaxe de alta calidade e alto contraste cun fondo negro, os filtros de excitación e emisión deberían conseguir unha alta transmisión cunha ondulación mínima da banda de paso sobre as rexións que corresponden aos picos ou emisións de excitación do fluoróforo.
3. Considere a durabilidade dos filtros de fluorescencia. Estes filtros deben ser impermeables ás fontes de luz intensa que xeren luz ultravioleta (UV) que poida provocar "queimaduras", en particular do filtro excitador xa que está sometido a toda a intensidade da fonte de iluminación.
As diferentes imaxes de mostra fluorescentes
Os recursos recóllense e organízanse en Internet, e só se utilizan para a aprendizaxe e a comunicación. Se hai algunha infracción, póñase en contacto connosco para eliminala.
Hora de publicación: Dec-09-2022